کاربرد آگروباكتريوم در انتقال ژن

آگروباکتریوم و کاربرد آن در انتقال ژن

آگروباكتریوم: نوعی باكتری خاكزی گرم منفی است كه باعث بیماری گال تاجی در گیاهان میشود.

A.tumefaciens: آگروباكتریوم توم فاسینس- تشكیل گال طوقه

A. rhizogenes: آگروباكتریوم ریزوژنز- بیماری ریشه های مویی

چگونه آگروباكتریوم باعث بروز بیماری می شود؟

تشابه ظاهری بین گال های تولید شده توسط آگروباكتریوم و تومورهای حیوانات توجه دانشمندان را در سالهای 1960 و 1970 به خود جلب كرد به این طریق كه گال ها به مانند سرطان میمانند؟در نهایت دانشمندان به این نتیجه رسیدند كه مگاپلاسمید برای بوجود آمدن بیماری ضروری است. مگاپلاسمید آگروباكتریوم تومفاسینس در نهایت به عنوان پلاسمید (القاكننده تومور) تعیین شد. به صورت مشابه مگاپلاسمید آگروباكتریوم ریزوژنز به عنوان پلاسمید  شناخته میشود. در ان زمان این طور فرض شد كه این پلاسمیدها ممكن است به صورت فعال وارد سلولهای میزبان شوند اما فناوری در ان زمان به اندازه كافی پیشرفته نبود تا قطعات كوچك در ژنوم بزرگ گیاه را تشخیص دهد.با بوجود آمدن تکینیک DNA نوترکیب (به عنوان مثال آنزیمهای برشی لكه گزاری یا بلات كردن) امكان اینكه صحت فرضیه انتقال DNA بررسی شود امكان پذیر شد. ثابت شده است كه تشكیل گال بستگی به فعالیت تعداد محدودی از ژنها (آنكوژنها) دارد كه برروی پلاسمید قرار دارند. این ژنها همچنین باعث سنتز تركیبات نیتروژنی غیر معمول (اپین ها) در بافت گال میشوند.

محل و چگونگی بوجود آمدن گال

آگروباكتریوم از محل زخم تازه وارد گیاه میزبان می شود.محل زخم دو اثر مهم در كلن شدن آگروباكتریوم دارد:

1- ترشح متابولیتهای فنولی كه آگروباكتریوم آنرا تشخیص میدهد و با فعال كردن ژنهای لازم برای انتقال DNA عكس العمل نشان میدهد 2- فضایی برای فعالیت تقسیم سلولی بوجود میاورد و در همین حال محل زخم ترمیم میشود.

القاكننده های Vir فنولی محصول متابولیسم فنل پروپانوید هستند به نظر میرسد كه اینها با مولكولهایی كه در استحكام مارپیچ پلی ساكارید دیواره سلولی نقش دارند مرتبط باشند( به عنوان مثال انتقال دهنده های فنلی و لیگنین های پلیمری).

القای Vir همچنین با حضور قندهای ساده و PH اسیدی كه هر دو آنها در اثر بروز زخم در گیاه بوجود میاید تشدید میشود.

آگروباكتریوم باید به صورت فیزیكی به دیواده سلولی متصل شود تا بتواند T-DNA خود را به گیاه انتقال دهد. وقتی تماس اولیه بر قرار شد باكتری ها شبكه در هم پیچیده ای از فیبریل های سلولزی (بتا- 1-4 گلوكان) را بوجود میاورند كه كمك میكند تا سلولها به دیواره سلولهای گیاهی متصل شوند.

جابجایی DNA:

بطورمعمول شامل یك پلاسمید بزرگ به اضافه كروموزمهای آن میباشد. فعالیتهای متفاوت بیولوژیكی آنها توسط ژنهایی كه روی پلاسمید هستند دیكته میشود.

Ti plasmid :

3 منطقه مهم برای جابحایی DNA و تشكیل غده وجود دارد: T-DNA، T-DNA Borders و منطقه Vir.

T-DNA:

دارای ژنهای كد كننده برای بیوسنتز فیتوهورمونها(اكسین و سیتوكینین) و ژنهای كد كننده برای سنتز اپین است که این ژنها فقط در گیاه رونویسی میشوند.

Opin ها قندها و پروتئین های نادری هستند که T-DNA، گیاه را مجبور به ساختن آنها می کند. این مواد بعنوان منبع غذایی از کربن و نیتروژن مورد استفاده باکتری قرار می گیرند. از مهمترین انواع اپاین ها، Nopalin ها و Octopin ها هستند:

nopaline = arginine + alpha-ketoglutarate

octopine = arginine + pyruvate

mannopine = glutamine + mannose

agrocinopine A = sucrose + arabinose

:T-DNA borders

24-25 جفت باز با ترتیب تكراری در هر دو طرف  T-DNAقرار دارند که  به نظر می رسد فقط طرف راست(Right Border) مهم باشد.

Vir region:

یک منطقه 35 كیلو بازی، شامل 6-9 واحد قابل رونویسی .(VirA, B, C, D, E, F, G, H, J)

برای تشكیل گال چهار لوكوس ویر قابل اهمیت است(A, B, D and G) .

بعضی از محصول فعالیت ژنهای ویر در داخل سلول باكتری است ولی بعضی دیگر منتقل میشوند و در داخل سلول میزبان عمل میكنند.

بیشتر ژنهای ویر در غیاب سلولهای میزبان خاموش هستند ولی VirA و VirG به مقدار کم رونویسی می شوند.VirA  و VirG به صورت یك سیستم كنترل كننده سلسله مراتب، بقیه ژنهای ویر را كنترل میكنند.

VirA با غشائ داخلی باكتری متصل گردیده و با ژن كروموزومی ChvE یک کمپلکس تشکیل می دهد. پیوند یك ملكول فنول خاص كه با Vir A كمپلكس تشكیل میدهد باعث فعالیت پروتئین كیناز و فسفریلیزاسیون میشود.

محصولات ژن (VirD1 and VirD2) virD به توالی سمت راست مرزی متصل شده و یك شكاف در انتهای T-DNA بوجود میاورند. این فعالت با محصولات ژن VirC که به توالی های مجاور متصل می شوند تشدید می شود.

پروتئین VirD2 با پیوندهای کووالانسی به انتهای رشته T، در طی مراحل انتقال متصل می ماند.

پروتئین VirE2 یک پروتئین متصل به DNA تک رشته ای است که چندین کپی از آن رشته DNA را احاطه می کنند. VirE2 نیز به میزبان منتقل می شود. محصولات ژن VirB یک ساختار ترشحی نوع 4 را تشکیل میدهد که در هدایت ساختار نقش دارد.

سایر نواحی پلاسمید  Tiنیز نقشهای مهمی ایفا میكنند:

ناحیه اتصال - توانایی اگروباكتریوم را برای تبادل پلاسمیدها با دیگر سلولهای باكتریایی كنترل میكند كه با سیستم انتقال T-DNAمشابه است.

ناحیه كاتابولیسم اپین- پروتئینهایی را كد میكند كه برای وارد كردن و استفاده كردن ازكلاس مشابه اپینهایی كه سنتز آنها بوسیلهT-DNA انجام می شود لازم است.

ناحیه همانند سازی پلاسمید - اجازه می دهد تا آگروباكتریوم پلاسمیدTi  را طی تقسیم سلولی نگه دارد

انتقال T-DNA و الحاق آن

مكانیزم دقیق انتقالT-DNA نامشخص است. این مكانیزم به انرژی نیاز داردو معمولا طی 4-2 ساعت بعد از تماس كامل می شود.

ژنهای گیاهی موثر در الحاق T-DNA

به نظر میرسد كه بسیاری از محصولات ژنهای گیاهی برای انتقال T-DNA به درون ژنوم گیاهی لازم هستند.این محصولات دارای نقش مستقیم در حمایت از الحاقT-DNA نیستند بلكه بیشتر رشد و نگهداری سلول گیاهی را حمایت می كنند.

ژنهایT-DNA و تشكیل تومور

T-DNA  حاصل از اگروباكتریوم دو نوع عملكرد دارد: تولیدهورمونهای گیاهی و سنتز اپین. ژنهایT-DNA دارای پروموترها وكدونهایی هستند كه به آنها اجازه میدهد تا بصورت قابل توجهی در سلولهای گیاهی ونه در سلولهای باكتری رونویسی شوند.

دامنه میزبانی

A-tumefaciens  دارای دامنه میزبانی وسیعی در خانواده دو لپه ها بوده و بازدانگان میزبان خوبی برای آن نیستند. به نظر میرسد كه این به علت عدم توانایی در تولید مواد القا كننده فنولی باشد. در موارد دیگرهم ممكن است ناسازگاری با سایر فاكتورهای موجود در گیاه میزبان به صورت بیوشیمیایی بروز كند.در بعضی موارد با استفاده از هم كشتی اگروباكتریوم با بافتهای اختصاصی (به عنوان مثال برگچه های لپه ای در براسیكا) توانسته اند بر این ناسازگاریها غلبه كنند.

در غیاب فعالیت انكوژنها چگونه می توان سلولهایی كه دارای قطعاتی از T-DNA هستند را شناسایی كرد؟

نشانگرهای قابل انتخاب:

تنها به بخش كوچكی از جمعیت سلولهای میزبان انتقال داده می شوند.

باید شرایطی را فراهم آورد تا سلولهایحاوی ژن نشانگرزنده مانده و سلولهایی كه به آنها ژن نشانگر انتقال نیافته، بمیرند یا رشد نكنند(= فشار انتخاب).

اولین عملكردهای نشانگر قابل انتخاب در میكروبیولوژی بود.

ژنهای مقاوم به آنتی بیوتیكها

بعضی آنتی بیوتیكها، مانند kanamycin  و hygromycin مانع رشد باكتریها و سلولهای گیاهی می شوند.

بعضی از ژنهای باكتریایی، پروتئین هایی كد میكنند كه باعث تخریب ساختمان آنتی بیوتیك شده و آنرا غیر فعال می سازد، به عنوان مثال نئومایسین فسفوترانسفرازII(nptII) II

در اختیار داشتن یك آنزیم تخریب كننده آنتی بیوتیك، مزیت انتخاب شوندگیرا به سلولهای گیاهی می دهد، یعنی  nptII یك ژن نشانگر قابل انتخاب است.

ژنهای نشانگر قابل انتخاب باید در هسته سلولهای گیاهی به صورت كارایی رونویسی شوند.

از پروموترهای مشهور برای این هدفnos (ژن نوپالین سنتتاز) و CaMV35S(از ویروس موزائیك كلم)هستند.

ژن مورد علاقه(هدف)

هر ژنی كه از قطعه T-DNA  بیان می شود باید:

یك پروموتر و یک ترمیناتور مناسب داشته باشد.

دارای یك توالی مناسب شروع كننده باشد.

دارای كدونهای قابل استفاده گیاهی باشد

ژنهای چند تایی میتوانند به صورت همزمان از یك سازه(كانستركت) بیان شوند.

اما محدودیت هایی وجود دارد كه عبارتند از:

اندازهDNA (بزرگتر = الحاق ناكاراتر) و اندازه ناقل كلن كننده (بزرگتر = كنترل و دستكاری سخت تر)

Explant Co-cultivation

یكی از گسترده ترین روشهایی كه استفاده میشود همكشتی ریز نمونه است: به سادگی ریزنمونه را در محلول كشت اگروباكتریوم كه دارای پلاسمیدTi تغییر یافته است فرو می برند. اجازه داده می شود كه مراحل آلودگی به صورت كاملانجام گیرد. سپس صبر می شود تا باقیمانده اگروباكتریوم توسط آنتی بیوتیكها از بین رفته و از محیط حذف شود.

در این روش به سازگاری بین اگروباكتریوم و گیاه میزبان اطمینان میشود.

انتخاب بافت، pH، دما، سویه اگروباكتریوم و القا كننده خارجی باید برای هر سیستمی بهینه شود.

زمانی كه انتقال ژن بوسیله اگروباكتریوم میسر نباشد(مانند گیاهان تک لپه)،از روش دوم انتقال مستقیم DNA به سلول هدف استفاده میشود:  Ballistic transformation       

سیستمهای جایگزین نشانگرهای انتخابگر

مقاومت به آنتی بیوتیكهایkan, hyg 

مقاومت به علف كشRound-up, Basta, Glean

فسفومانوز ایزومراز(PMI)

مراحل انتقال ژن توسط آگروباكتریوم:

ساخت(construct) 

competent كردن آگروباكتریوم

انتقال DNA به آگروباكتریوم

رشد آگروباكتریوم

هم کشتی (co-cultivation)

از بین بردن باكتری با آنتی بیوتیكهای مشخص

رشد احتمالی گیاهچه ها درمحیطهای انتخابی

وکتورهای دوگانه(Binary Vectors)

در اصلاح نباتات، بدلیل دشوار بودن دست ورزی ژنتیکی پلاسمیدها در درون آگروباکتریوم، از باکتری ای کولای نیز در انتقال ژن استفاده می شود، چرا که بدلیل تعداد بالای کپی های پلاسمید در درون ای کولای، دست ورزی پلاسمیدها سهل تر از آگروباکتریوم خواهد بود. همچنین کشف اینکه نیاز به حضور همزمان ژنهای بیماریزا(vir) و T-DNA در درون یک پلاسمید نیست، پژوهشگران را به استفاده از ناقلهای دوگانه ترغیب کرد. دو نوع پلاسمید خواهیم داشت: 1- پلاسمید خلع سلاح شده (Disarmed Ti plasmid ) که فاقد ژن بیماریزا بوده اما حاوی ژن مورد نظر جهت انتقال و همچنین ژنهای مارکر و دو ناحیه Ori)Origin Replication)برای هر دو نوع باکتری ای کولای و آگروباکتریوم می باشد. 2-پلاسمید کمکی(Helper vector) که حاوی ژنهای بیماریزا بوده و تنها Ori متعلق به آگروباکتریوم را در برگرفته و فاقد توالی T-DNA می باشد.

روال کار: پس از وارد سازی ژن هدف به پلاسمید خلع سلاح شده، این پلاسمید بدرون ای کولای انتقال می یابد و سپس بنابر تظاهر ژنهای مارکر(معمولا مقاوم به آنتی بیوتیک)، باکتریهای حاوی پلاسمید نوترکیب شناسایی شده و در مرحله بعد پلاسمید خلع سلاح شده، از طریق الکتروپوریشن(جریان الکتریسته) یا ایجاد تقاطع(Conjugation) به آگروباکتریوم حاوی پلاسمید کمکی انتقال می یابد. سپس با آلوده سازی بافت کالوس گیاهی حاصل از X-plant توسط آگروباکتریوم حاوی هر دو نوع پلاسمید، امکان انتقال ژن هدف به گیاه فراهم می شود. گفتنی است که ژنهای بیماریزای حاضر در پلاسمید کمکی، پروتئین های لازم جهت انتقال ژن(DNA) هدف بدرون گیاه را فراهم می آورند. در مرحله پایانی گیاهچه های تراریخته مقاوم به آنتی بیوتیک شناسایی و باززایی می شوند تا بتوان گیاه کامل حاوی ژن مورد نظر را بدست آورد.

مراحل انتقال ژن توسط تفنگ ژنی

ساخت constract

انتقال به E. Coli

رشد باكتری

استخراج(پلاسمید)DNA

رسوب دادن DNAبر روی ذرات طلا

تهیه ریز نمونه و استقرار آنها روی محیط

شلیك ذرات طلا و DNAبر روی ریزنمونه آماده شده

 جهت دانلود فایل پاورپوینت در مورد وکتورهای دوگانه و انواع هفتگانه آن بر روی لینک زیردانلود نمایید:

http://s2.picofile.com/file/7248776020/Binary_Vectors.zip.html